Polimerase kettingreaksiemetode
Die polimerase-kettingreaksie (PKR) of DNS-amplifikasie is 'n metode wat gebruik word om DNS te vermeerder sodat dit makliker bestudeer kan word. Deur dié proses word miljoene identiese replikas van 'n stuk DNS binne enkele ure vervaardig.
Voor PKR in 1983 deur 'n Amerikaanse wetenskaplike, Kary Mullis, uitgevind is, moes heelwat weefsel gebruik word om 'n DNS-profiel te verkry. Dit het ernstige praktiese probleme geskep: tensy die bloed of ander weefsel vrywillig geskenk is en behoorlik geberg is nadat dit die liggaam verlaat het, was daar selde genoeg genetiese materiaal beskikbaar vir bestudering.
Boonop was ouer ontledingsmetodes omslagtig, sodat DNS-studie 'n beperkte plek in genetiese navorsing gehad het. Danksy PKR is dit nou moontlik om DNS uit baie klein hoeveelhede weefsel - byvoorbeeld selle uit speeksel agter op 'n gebruikte seël, 'n enkele bloedspatsel of vanaf vel wat op 'n vingerafdruk agter gebly het - te bestudeer. DNS van 'n swak gehalte kan ook ontleed word, wat beteken dat selfs genetiese materiaal van mummies en van uitgestorwe diere soos mammoete en kwaggas nou toeganklik is. Daarby is dit moontlik om ooreenstemmende gene van 'n groot aantal spesies met mekaar te vergelyk en duidelikheid te verkry oor hul verwantskappe met mekaar.
Die diagnose van genetiese siektes is verder aansienlik vergemaklik, asook die bepaling van die menslike genoom se samestelling.
Een rede vir die sukses van PKR is dat dit 'n betreklik eenvoudige proses is wat nie hoogs gespesialiseerde toerusting vereis nie. As 'n wetenskaplike 'n bepaalde stuk DNS - byvoorbeeld 'n sekere geen by 'n pasiënt - wil bestudeer, is dit nie nodig vir hom om die geen te isoleer nie. Wat hy wel benewens DNS van die pasiënt nodig het, is trifosfaatnukleotiede, die ensiem DNS afhanklike DNS-polimerase en oligonukleotiede.
Laasgenoemde is stukke DNS - bestaande uit sowat 20 nukleotiede elk - wat op bepaalde plekke op chromosome voorkom. Om die gewenste stuk DNS te vermeerder, gebruik die navorser eksemplare van twee oligonukleotiede wat aan weerskante daarvan voorkom. Dié oligonukleotiede definieer eindpunte van die DNS wat vermeerder moet word.
Om die proses aan die gang te sit, word die mengsel van DNS en trifosfaatnukleotiede verhit. Dit laat die drade van die dubbelheliks waaruit DNS bestaan, skei. Die mengsel word weer afgekoel, en die oligonukleotiede heg hulself aan die ooreenstemmende DNS-drade. Die oligonukleotiede dien as afspringplekke waarvandaan die DNS polimerase basisse een vir een byvoeg:
Slegs die gedeelte tussen die oligonukleotiede word gerepliseer. Die proses van verhitting en verkoeling word oor en oor, gewoonlik 25 keer, herhaal tot genoeg kopieë van die gewenste stuk DNS verkry is. Om te voorkom dat die ensiem deur hitte afgebreek word, gebruik navorsers DNS-polimerase uit die warmwaterlewende bakterie Thermus aquaticus.
Na afloop van een siklus - wat 'n minuut of twee duur - is daar twee stukke DNS, na twee siklusse vier, na drie siklusse agt en na vier siklusse sestien. Danksy dié eksponensiële toename kan meer as 'n miljoen kopieë in minder as 'n uur verkry word.